Sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ Kit PCR phát hiện gen halothan trên heo

2


TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Lƣơng Quý Phƣơng, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2006,
“SẢN XUẤT BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA VÀ BỘ KIT PCR PHÁT HIỆN GEN
HALOTHAN TRÊN HEO”
Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân
2. PGS. TS. Trần Thị Dân
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 28-02-2006 đến ngày 28-07-2006 tại Trung Tâm
Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Gen halothan là gen có những tác động quan trọng đến phẩm chất thịt, sự sinh
trƣởng và sinh sản của heo. Do đó, sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR để
phát hiện gen halothan trong đàn heo giống một cách nhanh chóng, tiện lợi, hiệu quả.
Quá trình thực hiện đề tài đạt đƣợc những kết quả sau:
1. Rút ngắn thời gian tách chiết DNA: Giảm thời gian ủ mẫu trong dung dịch phân
giải tế bào từ 1 giờ còn 30 phút, giảm thời gian tủa DNA lần 1 từ 2 giờ còn 1 giờ,
không thực hiện giai đoạn tủa DNA lần 2, thực hiện việc hòa tan DNA trong TE trong
2 giờ thay vì để qua đêm. Độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA ở các thí nghiệm khác biệt
không có ý nghĩa so với độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA tách chiết theo qui trình của
Lê Thị Thu Phƣơng (2004).
2. Thiết lập đƣợc bộ kit tách chiết DNA cho 100 mẫu xét nghiệm. Thành phần bộ kit
gồm có 5 dung dịch. Độ tinh sạch, hàm lƣợng DNA và hiệu quả phản ứng PCR của
DNA tách chiết theo bộ kit khác biệt không có ý nghĩa so với qui trình của Lê Thị Thu
Phƣơng (2004). Nhƣng thời gian thực hiện công việc tách chiết DNA theo bộ kit ngắn
hơn (5 giờ so với 24 giờ). Có thể dùng bộ kit để tách chiết DNA từ mô cơ, mô máu,
da. Bộ kit tách chiết DNA có thể bảo quản ở 4
o
C trong 3 tháng.
3. Thiết lập bộ kit PCR phát hiện gen halothan cho 10 phản ứng. Nồng độ glycerol
20% trong Master Mix 2X sau 1 tháng bảo quản ở 4
o
C cho hiệu quả PCR cao hơn so
với nồng độ glycerol 10% (100% so với 20%). Bảo quản Master Mix 2X ở hai nhiệt
độ 4
o
C và 10
o
C sau 1 tháng đều cho tỷ lệ thành công phản ứng PCR là 100%.
4. Bộ kit PCR halothan phát hiện gen halothan với nồng độ DNA mẫu tối thiểu 1ng.
5. Bộ kit PCR halothan dùng để phát hiện gen halothan trên nhiều nguồn mẫu khác
nhau nhƣ cơ vân, máu, da.




3


MỤC LỤC


NỘI DUNG TRANG
Bìa i
Trang tựa ii
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt khóa luận iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt vii
Danh sách các bảng viii
Danh sách các hình và biểu đồ ix
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2
1.2.1 Mục tiêu 2
1.2.2 Yêu cầu 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Khái quát về gen halothan và cách phát hiện 3
2.1.1 Gen halothan 3
2.1.2 Ảnh hƣởng của gen halothan đến phẩm chất thịt 3
2.1.3 Ảnh hƣởng của gen halothan đến sức sinh sản 5
2.1.4 Những tác động tích cực của gen halothan 5
2.1.5 Cách phát hiện gen halothan 6
2.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA từ tế bào động vật và kỹ thuật PCR 7
2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA từ tế bào động vật 7
2.2.2 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế 8
2.2.3 Phƣơng pháp PCR 9
2.2.3.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR 9
2.3 Enzym cắt giới hạn 11
2.4 Nguyên tắc tạo kit tách chiết DNA và kit PCR 13
2.4.1 Kit là gì ? 13
2.4.2 Nguyên tắc tạo kit 13
2.4.3 Kit tách chiết DNA 13
2.4.4 Kit thực hiện phản ứng PCR 14
2.5 Tình hình sản xuất kit trên thế giới và Việt Nam 16
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 17
3.2 Nội dung nghiên cứu 17
3.2.1 Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA 17
3.2.2 Tạo kit tách chiết DNA 17
3.2.3 Tạo kit PCR để phát hiện gen halothan trên heo 17
3.3 Vật liệu và hóa chất 17
3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA 17
3.3.2 Các primer sử dụng 18




4


3.3.2.1 Đối với gen trên nhiễm sắc thể giới tính của bò 18
3.3.2.2 Đối với gen thụ thể estrogen trên heo 18
3.3.2.3 Đối với gen halothan trên heo 18
3.3.3 Hóa chất 19
3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA 19
3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di 19
3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR 19
3.3.3.4 Hóa chất dùng trong phản ứng cắt enzyme giới hạn HhaI 19
3.3.4 Thiết bị và dụng cụ 19
3.4 Phƣơng pháp tiến hành 19
3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 19
3.4.2 Thiết lập bộ kit tách chiết DNA 19
3.4.2.1 Tách chiết DNA từ cơ vân (Lê Thị Thu Phƣơng, 2004) (qui trình I) 19
3.4.2.2 Phƣơng pháp tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA 21
3.4.2.3 Xây dựng bộ kit tách chiết DNA 23
3.4.2.4 Hiệu quả của bộ kit tách chiết DNA đối với mô máu và da 24
3.4.2.5 Thực hiện phản ứng PCR 25
3.4.3 Thiết lập bộ kit PCR phát hiện gen halothan trên heo 27
3.4.3.1 Thiết lập thành phần bộ kit PCR và qui trình dùng bộ kit PCR 27
3.4.3.2 Khảo sát một số đặc tính của bộ kit PCR halothan 29
3.4.4 Cắt enzym giới hạn 30
3.4.5 Điện di và quan sát kết quả 30
3.4.5.1 Chuẩn bị gel agarose 1,5 % và 2 % 30
3.4.5.2 Điện di và đọc kết quả 30
3.5 Xử lý số liệu 30
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
4.1 Kết quả tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA 31
4.1.1 Giảm thời gian ủ mẫu trong dung dịch phân giải tế bào 31
4.1.2 Giảm thời gian tủa DNA lần 1 32
4.1.3 Không thực hiện giai đoạn tủa DNA lần 2 32
4.1.4 Giảm thời gian hòa tan DNA trong TE 33
4.2 Kết quả thiết lập bộ kit tách chiết DNA 34
4.2.1 So sánh hiệu quả tách chiết DNA theo qui trình bộ kit và qui trình I 34
4.2.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR 35
4.2.2 Thử nghiệm tính ổn định của bộ kit ly trích DNA từ cơ vân 38
4.3 Kết quả thiết lập bộ kit PCR phát hiện gen halothan 39
4.3.1 Kết quả khảo sát nồng độ glycerol trong Master Mix 2X 39
4.3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ bảo quản Master Mix 2X 41
4.3.3 Kết quả khảo sát độ nhạy của bộ kit PCR halothan 42
4.3.4 Hiệu quả của bộ kit PCR halothan với DNA tách chiết từ máu và da 44
4.3.5 Hiệu quả kinh tế của bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR halothan 46
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48
5.1 Kết luận 48
5.2 Đề nghị 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
PHỤ LỤC 52




5




DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bp: base pair
ctv: cộng tác viên
DNA: deoxyribonucleic acid
DTT: dithiothreitol
EDTA: ethylene diamine tetra acetate
NST: nhiễm sắc thể
OD: optical density
PCR: polymerase chain reaction
SDS: sodium dodecyl sulfate
Taq: Taq polymerase
TBE: Tris borate EDTA
TE: Tris EDTA
TN: Thí nghiệm
Tỷ số OD: tỷ số OD
260 nm
/ OD
280 nm

UI: unit
USD : United States Dollar
UV: ultra violet
VNĐ : Việt Nam Đồng





6


DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 3.1 Trình tự các đoạn primer cho gen giới tính 18
Bảng 3.2 Trình tự cặp primer của gen thụ thể estrogen 18
Bảng 3.3 Trình tự cặp primer của gen halothan 18
Bảng 3.4 Những yếu tố thay đổi để tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA từ cơ 22
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất trong bộ kit tách chiết DNA 23
Bảng 3.6 Thành phần hoá chất PCR 26
Bảng 3.7 Qui trình phản ứng PCR 26
Bảng 3.8 Thành phần hoá chất PCR 27
Bảng 3.9 Qui trình phản ứng PCR 27
Bảng 3.10 Thành phần hóa chất PCR (Lê Thị Thu Phƣơng, 2004) 28
Bảng 3.11 Thành phần hóa chất PCR Master Mix 2X 28
Bảng 3.12 Hỗn hợp thực hiện 1 phản ứng PCR với bộ kit 28
Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình tách chiết I và II 31
Bảng 4.2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình tách chiết I và III 32
Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình I và IV 33
Bảng 4.4 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình I và V 33
Bảng 4.5 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình I và bộ kit 35
Bảng 4.6 Tỷ lệ thành công khi PCR với primer của gen giới tính 36
Bảng 4.7 Tỷ lệ thành công khi PCR với primer của gen thụ thể estrogen 36
Bảng 4.8 Kết quả đo OD của DNA tách chiết theo bộ kit ở các thời điểm bảo quản 38
Bảng 4.9 Tỷ lệ thành công của phản ứng PCR với Master Mix 2X 39
Bảng 4.10 Tỷ lệ thành công của phản ứng PCR ở hai phƣơng pháp 39
Bảng 4.11 Tỷ lệ thành công của bộ kit PCR halothan ở 10
o
C 41
Bảng 4.12 Kết quả PCR ở các nồng độ DNA mẫu 43
Bảng 4.13 Chi phí hóa chất sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR 46





7


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ



HÌNH TRANG

Hình 2.1 Heo Pietrain bị stress 4
Hình 2.2 Sự tác động của gen halothan lên phẩm chất thịt 4
Hình 2.3 Nguyên lý của phản ứng PCR 11
Hình 2.4 Cấu tạo của glycerol 15
Hình 2.5 Cấu tạo của DTT 15
Hình 2.6 Cấu tạo của Tween 20 16
Hình 3.1 Bộ kit tách chiết DNA 23
Hình 3.2 Bộ kit PCR halothan 27
Hình 4.1 Sản phẩm PCR gen giới tính từ DNA tách chiết của hai qui trình 37
Hình 4.2 Sản phẩm PCR gen thụ thể estrogen từ DNA tách chiết của hai qui trình 37
Hình 4.3 Sản phẩm PCR gen halothan ở hai nồng độ glycerol 41
Hình 4.4 Sản phẩm PCR gen halothan ở hai nhiệt độ bảo quản 42
Hình 4.5 Sản phẩm PCR gen halothan ở các nồng độ DNA mẫu 43
Hình 4.6 Sản phẩm PCR gen halothan từ mẫu máu 44
Hình 4.7 Sản phẩm PCR gen halothan từ mẫu da 44
Hình 4.8 Sản phẩm cắt enzym giới hạn HhaI của gen halothan 45

BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 DNA tách chiết theo qui trình I và II 31
Biểu đồ 4.2 DNA tách chiết theo qui trình I và III 32
Biểu đồ 4.3 DNA tách chiết theo qui trình I và IV 33
Biểu đồ 4.4 DNA tách chiết theo qui trình I và V 34
Biểu đồ 4.5 DNA tách chiết theo qui trình I và qui trình bộ kit 35
Biểu đồ 4.6 Hiệu quả tách chiết DNA của bộ kit ở các thời điểm bảo quản 38
















8


PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Thế kỷ 21 đƣợc đánh giá là thế kỷ của công nghệ sinh học, không thể phủ nhận
những tác động to lớn và đầy tiềm năng của công nghệ này đến nhiều lĩnh vực của đời
sống kinh tế xã hội nói chung và trong lĩnh vực chăn nuôi nói riêng. Một trong những
kỹ thuật quan trọng của công nghệ sinh học là kỹ thuật PCR (polymerase chain
reactions) với ƣu điểm phát hiện nhanh, đặc hiệu đã hỗ trợ cho các nhà nghiên cứu có
nhiều thuận lợi trong công tác chọn tạo giống vật nuôi, rút ngắn thời gian chọn lọc
tính trạng di truyền mong muốn. Bên cạnh đó kết quả của kỹ thuật PCR còn là vật liệu
cho nhiều nghiên cứu sâu hơn …. Ở nƣớc ta hiện nay, phần lớn các kết quả thu đƣợc
từ việc áp dụng kỹ thuật này chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu trong phòng thí
nghiệm, chƣa có nhiều ứng dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất, thậm chí trong phòng
thí nghiệm thì việc áp dụng kỹ thuật này cũng gặp không ít trở ngại. Có nhiều nguyên
nhân để lý giải vấn đề này. Một nguyên nhân chính đó là việc áp dụng kỹ thuật PCR
khá tốn kém, dễ ngoại nhiễm và mất nhiều thời gian để có thể tối ƣu hóa một qui trình
PCR phát hiện đoạn gen mục tiêu một cách đặc hiệu và ổn định. Do vậy, nghiên cứu
sản xuất bộ kit để tách chiết DNA và bộ kit PCR là một đòi hỏi cấp thiết không chỉ
trong nghiên cứu mà còn trong thực tiễn sản xuất. Bộ kit giúp tiết kiệm thời gian trong
phát hiện, hạn chế nguy cơ ngoại nhiễm, dễ bảo quản, vận chuyển, hạn chế các lỗi do
pippet trong khi pha trộn các thành phần phản ứng, thao tác đơn giản, nhanh, tiện
lợi…. Nhƣ vậy, bộ kit sẽ giúp cho ngƣời sử dụng dễ dàng kiểm soát đƣợc các thông số
kỹ thuật trong thao tác và rút ngắn thời gian khi thực hiện PCR mà vẫn đạt đƣợc hiệu
quả mong muốn.
Trong khẩu phần ăn của con ngƣời, thịt là một trong những nguồn protein chính,
trong đó thịt heo đƣợc sản xuất và tiêu thụ lớn nhất trên thế giới (Franco và ctv, 1998).
Một trong các mối quan tâm lớn nhất trong quá trình sản xuất thịt heo là phẩm chất
thịt. Đây chính là tiêu chí quyết định đến tính cạnh tranh của sản phẩm trên thị trƣờng.
Ngoài ra, đối với ngành chăn nuôi heo, việc tạo đƣợc các giống heo có năng suất sinh
sản cao, tăng trƣởng nhanh cũng là nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học.





9



Gen halothan đƣợc xem là gen chủ chi phối nhiều tính trạng sản xuất nhƣng có
những ảnh hƣởng bất lợi đáng kể đến phẩm chất thịt, sự sinh trƣởng và sinh sản của
heo. Do đó, việc dùng bộ kit tách chiết DNA và kit PCR để xác định sớm, chính xác,
nhanh chóng kiểu gen của thú trƣớc khi đƣa vào đàn heo giống là hết sức cần thiết. Từ
yêu cầu đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit
PCR phát hiện gen halothan trên heo”.
1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1 Mục tiêu
Sản xuất bộ kit phát hiện gen halothan gồm có bộ kit tách chiết DNA và bộ kit
PCR.
1.2.2 Yêu cầu
- Nắm vững qui trình tách chiết DNA và phản ứng PCR.
- Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA.
- Tạo đƣợc bộ kit tách chiết DNA 100 mẫu, bộ kit PCR halothan cho 10 phản
ứng, đáp ứng tiêu chí nhanh, tiện lợi, hiệu quả, và có tính thƣơng mại.
- Kiểm tra độ tinh sạch, độ ổn định, định lƣợng DNA của bộ kit tách chiết
DNA.
- Kiểm tra độ nhạy, độ ổn định, điều kiện bảo quản của bộ kit PCR halothan.
- Kiểm tra hiệu quả của bộ kit PCR halothan trên các nguồn mẫu DNA khác
nhau.
- Tính toán hiệu quả kinh tế của bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR halothan.












10


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về gen halothan và cách phát hiện
2.1.1 Gen halothan
Năm 1991, một nhóm các nhà khoa học đứng đầu là MacLennan đã xác định
đƣợc trình tự gen halothan (Fujii và ctv, 1991). Ở heo, gen halothan nằm trên nhiễm
sắc thể số 6, gồm 2 alen: N và n, tạo nên 3 kiểu gen NN, Nn và nn. Theo MacLennan
và cộng sự, gen đột biến lặn n là kết quả của sự đột biến C-cytosin thành T-thymin ở
vị trí base 1843 của gen mã hóa thụ thể ryanodin (ryr-1), thụ thể này nằm trong kênh
phóng thích canxi của lƣới nội bào ở tế bào cơ (Fujii và ctv,1991). Sở dĩ ngƣời ta đặt
tên là gen halothan vì trƣớc đây để phát hiện kiểu hình của gen này ngƣời ta cho heo
ngửi chất gây mê bay hơi halothan. Nếu các chi heo duỗi thẳng và cứng cơ thì xác
định phản ứng halothan dƣơng tính và ngƣợc lại phản ứng halothan âm tính khi heo
dãn cơ bình thƣờng sau 3 phút ngửi chất gây mê này.
2.1.2 Ảnh hƣởng của gen halothan đến phẩm chất thịt
Hội chứng stress trên heo (PSS – porcine stress syndrom) là hội chứng rối
loạn thần kinh cơ di truyền ở heo (Franco và ctv, 1998). Hội chứng này đƣợc điều
khiển bởi gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể số 6 của tế bào bản thể (Houde và ctv,
1993). Heo mắc phải hội chứng này rất nhạy cảm với các tác nhân gây stress. Đây là
hội chứng gây thiệt hại rất lớn đối với ngành chăn nuôi heo công nghiệp đặc biệt là
những tác động của nó lên phẩm chất thịt. Các nguyên nhân dẫn đến PSS gồm có: thời
tiết nóng, đánh nhau, di chuyển xa, ồn ào, đói khát, thiến, tiêm vaccin. (Du, 2004).
Heo mắc phải hội chứng này có các triệu chứng sau đây:
 Sốt kiệt phát: với các biểu hiện khó thở (hơi thở ngắn và dốc), tăng thân
nhiệt (>41
o
C), cứng cơ, nổi mẩn xanh trên da.
 Chết đột ngột trong quá trình di chuyển.
 Giảm phẩm chất thịt: mô cơ trở nên nhạt màu, mềm, rỉ dịch (PSE – pale,
soft, exudative) hoặc sậm màu, cứng, khô (DFD – dark, firm, dry).




11



Hình 2.1 Heo Pietrain bị stress
(Nguồn: Chambers và Grandin, 2001)
Hội chứng PSS ảnh hƣởng quan trọng đến phẩm chất thịt (Lundstrom và
ctv,1989). Thịt PSE hình thành do sự tƣơng tác của nhiều yếu tố nhƣ di truyền, giống
heo, sự thay đổi bất thƣờng của thời tiết, vận chuyển đƣờng dài…. Heo mang gen
halothan dễ phát triển thịt PSE hơn so với heo không mang gen này (Du, 2004). Theo
Barton - Gade (1984), tỷ lệ quày thịt bị PSE ở heo mang kiểu gen nn là 79% - 100%,
heo mang kiểu gen Nn là 13% - 33%, heo mang kiểu gen NN là 0% - 33% (Lunsdrom
và ctv, 1989).


Thịt bình thƣờng Thịt PSE Thịt DFD
Hình 2.2 Sự tác động của gen halothan lên phẩm chất thịt
(Nguồn: Chambers và Grandin, 2001)
Thịt PSE không chỉ không đƣợc chấp nhận bởi ngƣời tiêu dùng vì thịt có màu
sắc nhợt nhạt, không hấp dẫn, bề mặt thịt mềm và rỉ dịch mà còn do thịt PSE không
thích hợp trong quá trình chế biến vì khả năng giữ nƣớc thấp. Thịt PSE thƣờng đƣợc
ghi nhận sau khi giết mổ 45 phút với màu sắc cơ nhợt nhạt; mô cơ mềm, rỉ dịch và
mất nƣớc nhiều hơn trong quá trình bảo quản lạnh, chế biến và đun nấu so với thịt
bình thƣờng. Thịt nhạt màu là do sự biến tính sắc tố cơ (myoglobin) dƣới điều kiện pH
thấp và nhiệt độ cao trong cơ. pH trong cơ thấp sau khi giết mổ là kết quả của quá
trình đƣờng phân và tăng tích lũy acid lactic trong cơ ngay trƣớc và trong khi giết mổ.

Xem chi tiết: Sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ Kit PCR phát hiện gen halothan trên heo